胚胎冷冻技术发展史：从实验到临床应用
概述
胚胎冷冻技术是辅助生殖技术(ART)中至关重要的组成部分，它为不孕不育患者提供了更多生育机会，同时也为医学研究和遗传学领域带来了新的可能性。这项技术的发展经历了从实验室研究到临床应用的漫长过程，如今已成为试管婴儿治疗中不可或缺的关键技术。
技术发展历程
| 年份 |
里程碑事件 |
主要贡献者 |
技术特点 |
| 1892年 |
杜瓦瓶发明 |
James Dewar |
发明双层真空玻璃容器，成为现代液氮罐原型 |
| 1949年 |
发现冷冻保护剂 |
Polge |
发现甘油可作为冷冻保护剂，使精子冷冻后仍具活力 |
| 1950年代 |
人类精子冷冻成功 |
Bunge和Sherman |
首次将甘油用于人类精子冷冻，1953年报道首例冷冻精子成功分娩 |
| 1963年 |
细胞冷冻理论研究 |
Mazur |
研究细胞冷冻过程中冰晶形成机制，奠定冷冻理论基础 |
| 1972年 |
首例哺乳动物胚胎冷冻成功 |
Mazur、Leiho和Whittingham |
使用1.5M二甲基亚砜冷冻小鼠胚胎，获得存活后代 |
| 1983年 |
首例人类胚胎冷冻成功 |
Trounson和Mohry |
成功冷冻复苏8细胞人类胚胎并移植后获得妊娠 |
| 1985年 |
玻璃化冷冻小鼠胚胎 |
Rail WF和Fahy GM |
首次成功使用玻璃化冷冻法保存小鼠胚胎 |
| 1990年代 |
程序冷冻技术成熟 |
- |
采用1,2-PROH和蔗糖作为冷冻保护剂，建立标准程序冷冻方案 |
| 1999-2005年 |
人类配子和胚胎玻璃化冷冻成功 |
Kuwayama M等 |
对人类卵母细胞、原核期胚胎、卵裂期胚胎和囊胚玻璃化冷冻成功 |
详细发展历程
胚胎冷冻技术的发展可以追溯到19世纪末，1892年剑桥大学教授James Dewar发明了用于保存液氧的双层真空玻璃容器，这一设计成为现代液氮罐的原型，为后来的生物样本低温保存奠定了基础。
真正的突破发生在1949年，Polge在Nature上发表文章，首次发现甘油可以作为冷冻保护剂，使精子经过冷冻后复苏仍具备活动能力。这一发现开创了冷冻活细胞的新纪元，为畜牧业和医学开辟了新天地。1950年代后，研究人员开始将冷冻保护剂应用于人类精子冷冻，Bunge和Sherman等人于1953年在Nature报道了第一个患者接受冷冻精子并成功分娩的病例。
1960-70年代是冷冻理论研究的黄金时期。Mazur在1963年详细观察了细胞在冷冻过程中细胞内发生的变化以及冰晶形成的过程，这些研究成为现代配子和胚胎冷冻的理论依据。Mazur后来还在90年代提出了胚胎的平衡冷冻法(程序冷冻)和非平衡冷冻法(玻璃化冷冻)的分类。
1972年，Mazur、Leiho和Whittingham合作，使用1.5M的二甲基亚砜作为冷冻保护剂，采用每分钟降低-0.3℃缓慢降温到-80℃的方法冷冻小鼠胚胎，放入液氮中保存，复苏后移植获得了存活的小鼠，这是首次哺乳动物胚胎冷冻后获得存活的后代。这一实验确立了缓慢降温能够改善胚胎脱水过程、减少冰晶形成的原理。
人类胚胎冷冻的临床应用始于1983年，Trounson和Mohry采用二甲基亚砜作为冷冻保护剂成功冷冻复苏了一枚8细胞的人类胚胎，并移植后获得妊娠。随后在1985年，甘油被用于人类囊胚的冷冻复苏后妊娠，1986年Testart将1,2-PROH应用于人原核期胚胎的冷冻，获得了更满意的妊娠率。至此，现代广泛采用的人胚胎程序冷冻方案已经比较成熟：采用1,2-PROH作为渗透性冷冻保护剂，蔗糖作为非渗透性冷冻保护剂，缓慢降温至-30℃后快速降温，采用杜瓦式液氮罐内的液氮保存冷冻的胚胎。
玻璃化冷冻技术的发展是另一个重要里程碑。虽然玻璃化冷冻方法用于细胞冷冻保存的最早报道见于1937年Luyet BJ的文献，1949年Polge在精子的冷冻保存中就使用过玻璃化冷冻的方法，但直到1985年Rail WF和Fahy GM才使用玻璃化冷冻法成功地冷冻了小鼠的胚胎，并发表在Nature上。1992年Nakagata对此方法进行了改进，成功冷冻卵母细胞和冷冻精子经体外受精得到了发育正常的后代。1999-2005年间，Kuwayama M、Isachenko V等人分别对人类卵母细胞、原核期胚胎、卵裂期胚胎和囊胚的玻璃化冷冻方法进行了成功的尝试，成为我们现在采用的配子和胚胎玻璃化冷冻方法的基础。
冷冻技术原理
胚胎冷冻技术主要分为两种方法：程序冷冻法(慢速冷冻)和玻璃化冷冻法(快速冷冻)。
程序冷冻法，或称平衡冷冻法，是由胚胎冷冻先驱Mazur提出的方法。基本过程是将胚胎放入含有一定浓度冷冻保护剂的冷冻液中处理后，慢速降温(0.2-2.0℃/min)至一个较低的温度(-35~-80℃)。在降温过程中胚胎会继续脱水。程序冷冻法已经应用多年，技术成熟，效果稳定，广泛地应用于IVF中原核期到囊胚期胚胎的冷冻保存。
玻璃化冷冻法则使用较高浓度的冷冻保护剂，快速降温，使全部液体固化而不形成冰晶。"玻璃化"一词来自拉丁语"vitreous"，意思是"玻璃样的"。玻璃化后的固态物质内分子和离子的分布情况与原始的液体相同，因此也可以把这种固态物质看做高度黏稠和低温的液体。相对于平衡冷冻法，玻璃化也被称为非平衡冷冻法。
冷冻保护剂的发展
冷冻保护剂是胚胎冷冻技术中的关键要素，从生物化学特性上分为渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂和其他冷冻保护剂。
渗透性冷冻保护剂(细胞内冷冻保护剂)通常为水溶性强的小分子物质，在冷冻过程中可以较快速地进入细胞内，降低细胞内外之间渗透压的差异，减缓细胞内水分渗出造成的细胞体积皱缩的程度和速度，并且能够减少冰晶的形成。这类冷冻保护剂主要包括二甲基亚砜(DMSO)和醇类(乙二醇、丙二醇和甘油)。
非渗透性冷冻保护剂(细胞外冷冻保护剂)多为大分子物质，不能自由穿过细胞膜，通过提高细胞外渗透压，使细胞脱水，减少细胞内冰晶的形成。常用的非渗透性冷冻保护剂包括蔗糖、海藻糖、聚蔗糖(Ficoll)等。
其他冷冻保护剂包括白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、右旋糖苷、羟乙基淀粉等大分子物质，能够起到维持溶液胶体渗透压，减轻细胞的物理性损伤的作用。还有学者尝试在冷冻液中加入抗冻蛋白(AFP)、热时蛋白(THPs)等具有特殊保护作用的蛋白质。
临床应用现状
现代胚胎冷冻技术已经成为辅助生殖治疗中不可或缺的一部分。冷冻胚胎的复苏率一般在90%以上，种植率在8%~30%，累计妊娠率超过60%。新鲜周期中，部分患者会有多个优质胚胎，把移植后多余的胚胎冷冻可以有效地保存生育力。
冷冻胚胎移植的成功率与新鲜胚胎移植相当，甚至在某些情况下更高。研究表明，冷冻胚胎移植出生的婴儿与新鲜胚胎移植出生的婴儿在健康状况上没有明显差异。目前已经有冷冻13年的胚胎解冻后移植成功分娩的报道，而且出生婴儿的健康状况良好。
玻璃化冷冻技术的应用使冷冻效果得到显著提升。玻璃化冷冻法通常能达到95%以上的回收率，如果囊胚冷冻，复苏率可达99%以上，明显高于程序冷冻法。因此，越来越多的生殖中心开始采用玻璃化冷冻技术。
未来展望
尽管胚胎冷冻技术已经取得了巨大进步，但仍有一些挑战需要克服。如何进一步提高解冻后的存活率，如何更好地理解冷冻过程中细胞内部的变化机制，以及长期冷冻对胚胎表观遗传学的影响等问题仍需深入研究。
随着科学技术的进步，胚胎冷冻保存技术将继续发展和完善。未来，我们有望看到更多创新性的冷冻保护策略，以及更加精准的解冻和复苏技术，为人类健康和科学研究带来更大的突破。同时，随着基因编辑技术的进步，冷冻胚胎技术可能会与基因治疗相结合，为预防遗传性疾病提供新的解决方案。
